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THÈSE - Isolement et caractérisation chez l'Eucalyptus de gènes codant les facteurs de transcription CBF impliqués dans la réponse au froid

Eucalyptus
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSEDélivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Biosciences Végétales

JURY
P. ROECKEL-DREVET Professeur Université Blaise Pascal, Clermont-Ferrand RapportriceE. TEOULE Maître de conférence HDR Paris VI, INRA de Versailles Rapportrice
J.-M. BOUVET Directeur Unité de Recherche 39 CIRAD, Montpellier Rapporteur
R. PONT-LEZICA Professeur Université Paul Sabatier, Toulouse Examinateur
C. TEULIERES Professeur Université Paul Sabatier, Toulouse Examinatrice

Ecole doctorale : Biologie – Santé - Biotechnologies
Unité de recherche : ERT 1045
Directrices de Thèse : C. TEULIERES et C. MARQUE
Présentée et soutenue par Gilles MARQUE

TABLE DES MATIERES

 Introduction générale 

CHAPITRE I Caractérisation phénotypique de la tolérance au froid chez Eucalyptus gunnii et autres eucalyptus 

1. Etude bibliographique : Eucalyptus et tolérance au froid 

1.1. L’Eucalyptus : une diversité importante 
1.1.1. Classification 
1.1.2. Description botanique 
1.1.3. Mode de reproduction 
1.1.4. Description des différentes espèces étudiées 
- Eucalyptus gunnii 
- Eucalyptus nitens 
- Eucalyptus pauciflora 
- Eucalyptus camaldulensis 
- Eucalyptus urophylla 
- Eucalyptus pellita 
- Corymbia maculata 
1.2. Tolérance au froid de l’Eucalyptus 
1.2.1. Tolérance par adaptation morphologique ou cellulaire 
1.2.1.1. Morphologie adaptée au froid 
1.2.1.2. Cellules adaptées au froid 
1.2.2. Acclimatation au froid 
1.3. Méthodes de mesure de la tolérance au froid chez l’Eucalyptus 
1.3.1. Estimations visuelles 
1.3.2. Mesure de la fuite d’ions à vitesse contrôlée jusqu’au gel dans un cryostat 
1.3.3. Mesure de la fluorescence de la chlorophylle 
1.3.4. Autres méthodes 

2. Résultats 

2.1. Tolérance au froid de plantules de plusieurs espèces issues de semis en conditions contrôlées 
2.1.1. Choix dans la gamme testée d’une vitesse de refroidissement 
2.1.1.1. Refroidissement à 2 °C /h sur plantules de 3 mois 
2.1.1.2. Refroidissement à 3 °C /h sur plantules de 4,5 mois 
2.1.1.3. Refroidissement à 2,5 °C /h sur plantules de 6 mois 
2.1.2. Choix d’une température de gel discriminante 
2.1.3. Classement des espèces par la tolérance intrinsèque 
2.1.4. Comportement de deux espèces pendant l’acclimatation au froid 
2.1.4.1. Etat des photosystèmes 
2.1.4.2. Tolérance intrinsèque et acclimatation 
2.2. Tolérance au froid de génotypes d’Eucalyptus gunnii provenant d’Australie 
2.2.1. Mesure de la croissance des plantules 
- Hauteur de l’axe principal 
- Nombre de feuilles sur l’axe principal 
- Nombre de branches sur l’axe principal 
2.2.2. Mesure de la tolérance au froid avant acclimatation 
2.2.3. Mesure de la tolérance au froid pendant l’acclimatation en jour court 
2.2.3.1. Acclimatation à 5 mois
2.2.3.2. Acclimatation à 9 mois
2.2.3.3. Classement des individus pour leur tolérance au froid 

3. Discussion 

CHAPITRE II Isolement et caractérisation des gènes CBF (C-repeat Binding Factor) 

1. Etude bibliographique : les gènes de réponse au froid chez les végétaux 

1.1. Les différentes voies de réponse aux stress abiotiques chez les végétaux 
1.1.1. Les voies de réponse à la sécheresse et au stress salin
1.1.2. La voie CBF dans la réponse au froid 
1.2. La famille multigénique des facteurs de transcription CBF 
1.2.1. Phylogénie et composition de la famille CBF 
1.2.2. Les différents CBF isolés chez les plantes 
- Chez Arabidopsis thaliana 
- Chez les ligneux 
1.2.3. Rôle des CBF dans la tolérance au froid 
1.2.3.1. Expression des gènes CBF par transgénèse 
- En système homologue chez Arabidopsis 
- En système hétérologue 
1.2.3.2. Etude génétique par colocalisation avec des QTL 

2. Résultats 

2.1. Isolement des séquences EguCBF1 chez Eucalyptus gunnii 
2.1.1. Séquences isolées par une approche PCR 
2.1.2. Séquences issues de banques d’ADNc 
2.2. Caractérisation des séquences EguCBF1 
2.2.1. Analyse de la séquence codante complète 
2.2.2. Analyse du domaine AP2 et modélisation de la structure 
2.2.3. Analyse du domaine activateur COOH-terminal 
2.3. Recherche des différents allèles de chaque groupe de CBF 
2.3.1. Isolement de nouvelles séquences CBF 
2.3.2. Polymorphismes des CBF pleine longueur 
2.3.3. Recherche de cis-éléments dans le promoteur des EguCBF1 
2.4. Isolement des séquences CBF chez d’autres Eucalyptus ou Corymbia 
2.4.1. Amplification de la partie codante du CBF1a 
2.4.2. Amplification d’un gène entier 

3. Discussion 

CHAPITRE III Phénotypage moléculaire de génotypes d’Eucalyptus gunnii et polymorphismes de séquence sur un gène CBF 

1. Etude bibliographique : la tolérance au froid des plantes en milieu naturel et les polymorphismes des gènes CBF 

1.1. Variabilité naturelle dans la tolérance au froid 1.1.1. Chez Arabidopsis thaliana 
1.1.2. Chez l’Eucalyptus 
1.2. Les polymorphismes de gènes CBF impliqués dans la tolérance au froid 
1.2.1. Types de polymorphismes et marqueurs utilisables 
1.2.2. Polymorphismes des gènes CBF reliés à la tolérance au froid 

2. Résultats 

2.1. Expression des gènes CBF après passage au froid de plantes d’Eucalyptus 
2.1.1. Expression chez des plantules de trois espèces d’Eucalyptus 
2.1.1.1. Après choc au froid 
2.1.1.2. Après acclimatation
2.1.2. Expression chez des plantules d’Eucalyptus gunnii de provenances 
tasmaniennes 
2.1.2.1. Après choc au froid 
2.1.2.2. Expression en fonction des organes 
2.1.2.3. Après acclimatation 
2.1.3. Expression chez des arbres d’Eucalyptus gunnii plantés en France 
2.1.3.1. Mesure de la tolérance au gel sur des clones 
2.1.3.2. Mesure de l’expression CBF chez des clones 
2.2. Analyse en composante principale des variables de tolérance au froid
et d’expression CBF à 5 mois 
2.2.1. Choix des variables analysées 
2.2.2. Corrélations obtenues après analyse 
2.3. Recherche de polymorphismes de séquences des gènes CBF sur des plantules d’Eucalyptus gunni 
2.3.1. Choix du membre CBF dans la famille EguCBF1 
2.3.2. Amplification par PCR sur ADN génomique de 14 génotypes 
2.3.3. Polymorphismes de séquences 
- Caractérisation des polymorphismes 
- Reconstitution d’haplotypes 

3. Discussion 

Matériel et méthodes 
1. Matériel végétal
1.1. Plantules issues de semis en conditions contrôlées 
- Origine des graines d’eucalyptus 
- Semis des graines et conditions de culture 
1.2. Arbres cultivés en France 
2. Méthodes 
2.1. Caractérisation de plantules d’eucalyptus pour la tolérance au froid
2.1.1. Mesure de l’efficience des photosystèmes par fluorescence 
de la chlorophylle 
2.1.2. Test de tolérance au gel avec le cryostat 
- Passage des échantillons en conditions de gel contrôlé 
- Estimation de la tolérance au gel par la mesure de la fuite d’ions 
2.1.3. Tolérance après acclimatation des plantes 
2.2. Isolement des séquences sur ADN génomique 
2.2.1. Extraction des ADN totaux 
2.2.2. Dosage des ADN et vérification de leur qualité sur gel 
2.2.3. Amplification par PCR 
- Allongement de séquences partielles
- Recherche des polymorphismes par PCR 
2.2.4. Purification des produits PCR 
2.2.5. Ligation et clonage dans Escherichia coli 
2.2.6. Extraction plasmidique et séquençage 
2.3. Etudes d’expression 
2.3.1. Extraction et dosage des ARN totaux 
2.3.2. Analyse par PCR en temps réel (RT-PCR)
- Choix des amorces
- Synthèse d’ADNc 
- Dosage et dilution des ADNc 
- Amplification en temps réel 
2.4. Analyse des données 
- Obtention des contigs et identification des CBF 
- Analyse des séquences 
- Recherche de polymorphismes 
- RT-PCR 
- Modélisation des protéines CBF
- Comparaison de moyenne et analyse de variance 
- Analyse en Composante Principale (ACP) 
 Conclusion générale 
 Références bibliographiques 

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Ditulis oleh: younes younes - mercredi 17 octobre 2012

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