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THESE - VAD1, un régulateur putatif de la mort cellulaire hypersensible chez Arabidopsis thaliana. Analyse fonctionnelle et recherche de nouvelles composantes des programmes de mort cellulaire associés à VAD1.

Arabidopsis thaliana
UNIVERSITE TOULOUSE III-PAUL SABATIER
U.F.R. Sciences de la Vie et de la Terre

THESE 
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III
En BIOSCIENCES VEGETALES
Présentée et soutenue par Olivier BOUCHEZ
JURY :
EXPERT Dominique, Directeur de Recherche CNRS, Paris, Rapporteur WENDEHENNE David, Professeur de l’Université de Bourgogne, Dijon, Rapporteur
ARLAT Matthieu, Professeur de l’université Paul Sabatier, Toulouse, Examinateur
DIXELIUS Christina, Professeur de “Department of Plant Biology and Forest Genetics,
Swedish University of Agricultural Sciences”, Uppsala, Suède, Examinateur
ROBY Dominique, Directeur de Recherche CNRS, Toulouse, Examinateur
BALAGUE Claudine, Chargée de Recherche CNRS, Toulouse, Directeur de Thèse

SOMMAIRE
 
AVANT-PROPOS. 
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE  

I. La mort cellulaire chez les eucaryotes 

I.1. Les différents types de mort cellulaire programmée chez les animaux 
I.2. Quelques acteurs de l’apoptose chez les animaux 
1.2.1. Les caspases 
1.2.2. Les membres de la famille Bcl-2
I.3. Types de mort cellulaire chez les plantes et rôles 

II. La HR, une forme de mort cellulaire associée à la résistance chez les plantes

II.1. La Reconnaissance : étape clef dans la mise en place de la HR II.1.1. Effecteurs microbiens et systèmes de reconnaissance  
II.1.1.1. Deux principaux modèles de reconnaissance R/Avr  
II.1.1.2. Les effecteurs microbiens : rôles dans la mise en place de la PCD 
II.1.2. Les protéines R et le rôle de leurs domaines dans la régulation de la PCD 
II.1.3. Complexes R/Avr et régulation de la mise en place de la PCD 
II.2. Signalisation précoce associée à la mise en place de la HR 
II.2.1. Les flux ioniques : première réponse des plantes ?  
II.2.1.1. Le Ca2+, un ion essentiel pour la mise en place de la HR 
II.2.1.2. Les ions K+, Cl-, H+ et Na+ 
II.2.2. Les ROS comme molécules essentielles au contrôle de la HR 
II.2.2.1. Implication des ROS lors de la HR 
II.2.2.2. Implication des compartiments cellulaires et production des ROS lors de la HR 
II.2.2.3. Production des ROS et signalisation 
II.2.3. Le NO 
II.2.3.1. Systèmes de production du NO 
II.2.3.2. Implication du NO durant la HR 
II.2.3.3. Signalisation associée à la production du NO 
II.2.4. Interactions entre les ROS et le NO 
II.2.5. Rôle des protéines Kinases dans l’établissement de la HR 
II.2.6. EDS1, PAD4, SAG101, NDR1 : composantes clef de la signalisation associée à la reconnaissance spécifique 
II.2.7. Autres acteurs impliqués dans la signalisation associée à la reconnaissance
spécifique 
II.3. Le contrôle hormonal de la HR  
II.3.1. SA : rôle majeur dans la HR et la résistance
II.3.1.1. Production du SA
II.3.1.2. Signalisation associée à SA : rôle de NPR1  
II.3.1.3. SA et les autres composantes de signalisation 
II.3.1.4. Contrôle de la production/accumulation de SA  
II.3.2. Le JA et la limitation de la HR 
II.3.2.1. Voie de signalisation associée à JA 
II.3.2.2. Rôle du complexe SCFCOI1 dans les réponses au JA  
II.3.3. L’éthylène : une molécule à multiples fonctions notamment la régulation de la HR
II.3.3.1. Voies de biosynthèse et de signalisation de l’éthylène  
II.3.3.2. L’éthylène et la régulation de la HR 
II.3.3.3. L’éthylène et son implication dans la PCD liée à la maladie 
II.3.4. Interactions entre SA, JA et ET : un réseau complexe 
II.3.4.1. Interactions entre SA et JA  
II.3.4.2. Interactions entre SA et ET 
II.3.4.3. Interactions entre JA et ET 
II.4. Rôles des lipides dans la mise en place de la PCD  
II.5. Acteurs impliqués dans l’exécution HR
II.5.1. Preuves d’un contrôle génétique  
II.5.2. Acteurs de la mort cellulaire chez les plantes 
II.5.2.1. Acteurs identifiés par la recherche d’homologues des régulateurs apoptotiques chez les
animaux 
II.5.2.1.1. Activités de type caspases 
II.5.2.1.2. Régulateurs de type BI-1 (BAX-inhibitor-1)  
II.5.2.1.3. Régulateurs de type DAP/AIF 
II.5.2.2. Autres acteurs 
II.5.2.4. Les LMM : un outil ayant fait ses preuves pour déchiffrer les mécanismes de contrôle de la HR 
II.5.2.4.1. Identification des LMM II.5.2.4.2. Etablissement de la HR chez les LMM. 
II.5.2.4.3. Les voies de signalisation de la résistance chez les LMM 
II.5.2.4.4. Les fonctions révélées par les LMM  

III. Conséquences de l’activation de la HR 

III.1. Activation de l’expression des gènes de défense III.2. Mise en place de la LAR  
III.3. Mise en place de la SAR 

IV. Travaux antérieurs 

IV.1. Caractérisation du mutant  
IV.2. vad1 et les voies de signalisation 
IV.2.1. La mort cellulaire chez vad1 est partiellement dépendante de EDS1 et de NDR1
alors que l’augmentation de la résistance requiert les deux protéines. 
IV.2.2. Les phénotypes associés à la mutation vad1 sont dépendants de SA 
IV.3. Clonage de VAD1, identité de la protéine et expression  
IV.4. Questions posées et projet de thèse 
RESULTATS 

Chapitre I : Etude de la fonction de VAD1 

Introduction 

I. Quelles fonctions pour VAD1 ? 

I.1. Analyse in silico
I.1.1. Analyse de la région promotrice du gène VAD1
I.1.2. Recherche d’homologues de VAD1
I.1.3. Modifications post-traductionnelles
I.2. Effet de la surexpression in planta de VAD1
I.2.1. Expériences d’expression transitoire  
I.2.3. Analyse de lignées d’Arabidopsis surexprimant VAD1  
I.2.3.1. Phénotype développemental des différentes lignées transgéniques générées  
I.2.3.2. Phénotype de lignées surexprimant VAD1, après inoculation avec une souche avirulente  

II. Etude de la localisation subcellulaire de VAD1  

II.1. Analyse in silico
II.2. Etude de la localisation tissulaire, cellulaire et subcellulaire de VAD1 in 
planta 
II.2.1. Analyse de la localisation de VAD1 par des expériences d’expression transitoire 
chez Nicotiana benthamiana
II.2.2. Analyse de la localisation de VAD1 dans des lignées transgéniques d’Arabidopsis 

III. Discussion, conclusions, perspectives 

III.1. VAD1 : un régulateur négatif de la mise en place de la HR ? III.2. Régulation de la protéine VAD1 

Chapitre II : Placement de VAD1 dans les voies de signalisation conduisant à la HR et à la résistance  

I. Données publiées. II. Données complémentaires aux données publiées 
II.1. Résistance des doubles mutants vad1-1/ein2-1, vad1-1/ein4-1 et vad1-
1/35S::ERF1 à PstDC3000 et PstDC3000/avrRpm1 
II.2. Interconnections entre voie SA et ET/JA et impact sur l’expression de VAD1
 III. Discussions-Conclusions 
III.1. La mort cellulaire, l’expression constitutive des marqueurs de défense et la 
résistance chez le mutant vad1-1 sont dépendantes des voies de signalisation SA, ET et JA
III. 2. Régulation de l’expression de VAD1 : existence d’une boucle de 
rétrocontrôle de la production de SA et de l’ET par VAD1 ? 

Chapitre III : Vers la recherche de composantes des voies de signalisation conduisant à la mort cellulaire associée à VAD1.  

I. Les approches génétiques : un outil puissant pour étudier un processus biologique  

I.1. Introduction  I.2. Exemples de suppresseurs déjà identifiés pour des mutation affectant la résistance et la HR 

II. Mutagenèse et identification des suppresseurs de la mutation vad1 

II.1. Mutagenèse et criblage  
II.2. Quatre groupes de suppresseurs.
II.2.1. Mutants présentant des lésions différentes de celles observées chez vad1-1  
II.2.2. Mutants de taille réduite sans lésion 
II.2.3. Mutants de taille intermédiaire et sans lésion 
II.2.4. Mutants présentant un phénotype sauvage 
II.3. Caractérisation génétique et moléculaire de suppresseurs vad1-1/svd  
II.3.1. Récessivité/dominance des mutations 
II.3.2. Tests d’allélisme. 
II.3.3. Ces mutations sont-elles intra- ou extragéniques ?  
II.4. Caractérisation phénotypique des doubles mutants vad1-1/svd4, 11, 29, 42 et 118. 
II.4.1. Analyse de l’expression des marqueurs défense chez les doubles mutants vad1-1/svd
II.4.2. Analyse de la résistance des doubles mutants vad1-1/svd
III. Discussion, conclusions, perspectives 
III.1. Discussion-conclusions 
III.1.1. Plusieurs types de mutations svd 
III.2.2. Mutations svd : régulateurs communs de la PCD, de l’expression des marqueurs 
de défense et de la résistance ?  
III.2.3. Le cas particulier de la lignée vad1-1/svd 118 . 
III.2. Perspectives  
DISCUSSION PERSPECTIVES 

I. Quelles fonctions biochimiques pour VAD1 dans la mise en place de la HR ?

 I.1. Localisations tissulaire et cellulaire : des fonctions diverses pour VAD1 ? 
I.1.1. VAD1 et les autres formes de mort cellulaire 
I.1.2. Expression de VAD1 au niveau des stomates  
I.2. Localisation subcellulaire : un mode de régulation de la fonction de VAD1 ?
I.2.1. Un rôle au niveau des chloroplastes ?
I.2.2. Possibilité d’une multi-localisation ? 
I.3. Quelles fonctions révélées par la surexpression de VAD1 ? 
I.3.1. La surexpression de VAD1 conduit à une limitation en intensité de la HR  
I.3.2. VAD1 et les autres régulateurs négatifs de la mort cellulaire  
I.4. Quelles fonctions pour le domaine GRAM ?  
I.5. Domaine transmembranaire : important pour la fonction de VAD1 ? 

II. Régulations post-transcriptionnelles et post-traductionnelles de VAD1 

II.1. Régulation de l’expression de VAD1 
II.2. Régulations post-traductionnelles : un rôle pour les domaines PEST et pour
la sumoylation ?  

III. Partenaires de VAD1 dans le contrôle de la PCD 

III.1. Suppresseurs : composantes possibles des voies de signalisationconduisant à la HR et à la résistance ? 
III.2. La HR n’est pas supprimée chez les doubles mutants vad1/svd 
III.3. Mutation de type eds pour la lignée vad1/svd118 ?  
III.4. Modification de la spécificité tissulaire des lésions
III.5. Découplage entre mort cellulaire et phénotype développemental 
IV. Modèle général d’action de VAD1 dans les voies contrôlant la mort cellulaire associée à la HR  
MATERIEL ET METHODES
I. Matériel biologique
I.1. Matériel végétal
I.2. Souches bactériennes et préparation des solutions bactériennes 
II. Traitements et analyses biologiques 
II.1. Inoculations bactériennes, analyses phénotypiques et détermination de la croissance bactérienne in planta  
II.2. Traitement des plantes et détermination de la production d’éthylène  
II.3. Génération des doubles mutants
II.4. Mutagenèse EMS
III. Techniques de biologie moléculaire
III.1. Extraction d’ADN à partir de feuilles d’Arabidopsis
III.2. Extraction des ARN totaux des feuilles . 
III.3. Amplification des acides nucléiques  
III.3.1. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 
III.3.2. Transcription inverse
III.3.3. PCR quantitative
III.4. Obtention des différentes constructions et souches bactériennes 
III.5. Transformation et sélection des plantes transgéniques 
III.5.1. Transformation transitoire des plantes de Nicotiana benthamiana 
III.5.2. Transformation stable des plantes d’Arabidopsis 
III.5.3. Sélection des plantes transgéniques d’Arabidopsis. 
IV. Microscopie photonique et confocale 
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 

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Ditulis oleh: younes younes - mercredi 17 octobre 2012

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