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Thése - Les Bactéries Nodulant les Légumineuses (B.N.L) : caractérisation des bactéries associées aux nodules de la Légumineuse Fourragère, Hedysarum perrauderianum

Bactéries Nodulant les Légumineuses
Université Mentouri de Constantine
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département de Biologie Végétale
Sebihi Fatima Zohra
 

INTRODUCTION
L'azote est un facteur limitant majeur de la production agricole, alors que l'atmosphère  terrestre est constituée à 80% d'azote. Ce paradoxe est dû au fait que l'azote moléculaire (N2)  est une molécule très stable, que seuls les organismes appartenant au groupe des procaryotes  
(mais aucun organisme eucaryote) sont capables de le réduire sous une forme combinée  

assimilable. Les systèmes fixateurs les plus efficaces sont des symbioses qui réalisent un  
couplage entre la fixation d'azote et la photosynthèse.


La fixation biologique de l'azote, joue un rôle majeur dans le cycle de l'azote. Les  bactéries fixatrices d'azote possèdent un complexe enzymatique, appelé nitrogénase, qui  assure la réduction de l'azote moléculaire en ammoniaque. Ces bactéries présentent une très  
grande diversité dans leur mode de vie et leur association avec les végétaux.

La famille des légumineuses, premier hôte de l’association, renferme trois sous  
familles : Mimosoideae, Caesalpinoideae et Papillionoideae ; la majorité des espèces  

nodulées se rencontrent dans la sous famille des Papilionoideae. Le genre Hedysarum est un  

parmi les plus répandu dans le monde ; plusieurs espèces sont rencontrées en Algérie dont  

certaines sont endémiques ( Hedysarumnaudinanum , Hedysarum perrauderianum).

Les rhizobia, deuxième élément de l’association, sont des bactéries du sol capables  
d'induire sur les racines des légumineuses la formation d'organes particuliers, les nodosités, au  

sein desquels ils réduisent l'azote de l'air. Dans cette association à bénéfice mutuel, la plante  

fournit une niche protectrice et de l'énergie aux bactéries qui, en échange, synthétisent de  

l'ammoniac pour leur hôte. Cette symbiose Rhizobium-Légumineuse (actuellement  

dénommée Symbiose Légumineuse-BNL selon de Ladjudie, 2006) fournit chaque année, à  

l'échelle de la planète, une quantité d'azote équivalente à celle synthétisée par voie chimique  

dans l'industrie des engrais, et joue donc un rôle écologique et économique considérable.

En effet, des bactéries appartenant à différents genres et classes taxonomiques sont  
aujourd’hui connues pour leur capacité symbiotique. Ainsi, les genres Rhizobium,  

Sinorhizobium, Mesorhizobium, Ochrobactrum, Allorhizobium, Azorhizobium,  

Methylobacterium , Bradyrhizobium , Blastobacter, Devosia , Burkholderia, Ralstonia ainsi  

que certaines γ-protéobactéries (Benhizia et col. 2004), forment actuellement l’ensemble des  

bactéries connues comme symbiotes des légumineuses.

L’objectif de notre étude est l’identification des bactéries associées aux nodules de la  
légumineuse fourragère Hedysarum perrauderianum. 


Ce travail consiste en une caractérisation phénotypique et génotypique des bactéries  

isolées des nodules racinaires de cette légumineuse fourragère.

Sommaire

Chapitre Un : Synthèse bibliographique

I- La fixation de l’azote;

1-1- L’azote;
1-2- Les principales sources d’azote ;
1-2-1 Le sol ;
1-2-2- Les amendements organiques ;
1-2-3- Les engrais minéraux ;
1-2-4- L'atmosphère ;
1-2-5- La fixation symbiotique. ;
1-2-6- Fixation industrielle de l’azote;

II- Fixation biologique de l'azote ;

2-1- Les fixateurs libres .
2-2- Les fixateurs symbiotiques .
2-3- Physiologie de la symbiose .
2-4- Biochimie de la Fixation .
2-4-1 -La nitrogénase .
2-4-2- La leghémoglobine .
2-4-3-Assimilation de l'ammonium .
2-4-4-Spécificité de la symbiose .
2-5- Génétique de la Fixation de l’azote .
2-5-1-Facteur Nod 16
2-5-2-Régulation de gène nodD .

III- Les légumineuses .

3-1-Généralités .
3-2-Classification .
3-3-Importance .
3-4- Le genre Hedysarum .

IV- Le Micro–Symbiont: les bactéries nodulant les Légumineuses (B.N.L.) .

4-1-Classification des bactéries nodulant les Légumineuses (B.N.L) .
4-2- Coexistence des bactéries avec des rhizobia dans les nodules des légumineuses .

Chapitre Deux : Matériels et méthodes .

1-Isolement des bactéries à partir des nodules .

1-1- Collecte des nodules .
1-2- Conservation et Stérilisation des nodules .
1-3- Isolement des bactéries à partir des nodules .
1-4- Observations des colonies et conservation des isolats .

2 - Caractéristiques métaboliques des isolats .

2-1- Vitesse de croissance, absorption du rouge Congo et coloration au Calcofluor .
2-2- Tests distinctifs entre Rhizobium et Agrobacterium .
a) Test du 3-Cétolactose .
b) Précipitation du Ca- Glycérophosphate .
c) Croissance sur Litmus Milk (Lait Tournesolé) .
2-3- Recherche des enzymes .
a) Réduction des nitrates .
b) Activité cellulosique .
c) Activité pectinolytique .
d) Hydrolyse de l’urée .
e) La recherche de la b-galactosidase .
2-4- Tests nutritionnels .
a) Utilisation de la source de carbone .
b) Utilisation des acides aminés comme source d’azote .
c) Besoin en vitamines .

3- Effet des Facteurs abiotiques .

3-1- Tolérance au Chlorure de Sodium .
3-2- Effet de la température .
3-3- Croissance à différents pH .
3-4- Résistance intrinsèque aux métaux lourds .

4- Caractérisation des rhizobia par la sensibilité aux phages .

4-1- Isolement des bactériophages .
4-2- Analyse des phages par la méthode de double couche .

5- Test de nodulation (prestations symbiotiques avec la plante-hôte) .

5-1- Croissance bactérienne .
5-2- Préparation des jarres de Léonard .
5-3 - Stérilisation des graines .
5-4 - Inoculation des jarres .

6-Détermination des profils protéiques sur SDS-PAGE .

6-1- Introduction .
6-2- Protocole .

7-Caractérisation phylogénétique des isolats .

7-1 -Analyse des fragments de restriction de l’ADN amplifié .
a-Extraction de l’ADN .
b-Analyse des fragments de restriction de l’ADN amplifié .
7-2- Séquençage de l’ADNr 16S par la méthode Sanger .

Chapitre Trois : Résultats

1-Caractéristiques morphologiques, culturaux et physiologiques des isolats .

1-1 Croissance sur YMA .
1-2- Croissance sur YMA+ Rouge Congo .
1-3-La vitesse de croissance .
1-4- Croissance sur YMA+ Calcofluor .
1-5-Tests distinctifs entre Rhizobium et Agrobacterium .
1-6-Recherche d’enzymes spécifiques .
1-7- Utilisation de la source de Carbone et d’azote, besoin en vitamines .
a) Utilisation de la source de carbone .
b) Assimilation de la source d’azote .
c) Besoin en vitamines .

2- Effet des facteurs abiotiques (pH, T°C et NaCl) .

2-1- Tolérance au NaCl .
2-2-Température de croissance .
2-3- Effet du pH .

3- Ecologie des isolats (sensibilité aux métaux lourds et aux rhizobiophages .

4- Test de nodulation .
5- Détermination des profils protéiques sur SDS-PAGE .
6-Caractérisation phylogénétique des isolats .
6-1- Profil ARDRA .
6-2- Le Blast : H. perrauderianum .

Chapitre Quatre : Discussion et conclusion

Discussion et conclusion .
Références bibliographiques .
Annexes .

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Ditulis oleh: younes younes - jeudi 13 décembre 2012

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